周围神经损伤后肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的变化*
王思嘉**，吴 宸，张 铭，黄 灵，蔡洪玉，李贵才，易 晟
（南通大学神经再生重点实验室，神经再生协同创新中心，江苏226001）
[摘 要] 目的：探讨肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在周围神经损伤后的变化。方法：将30只SD大鼠随机分为4个实验组和1个对照组，实验组制作坐骨神经夹伤模型，并于伤后0、1、4、7、14天取材。使用深度测序结合生物信息学的方法分析坐骨神经组织损伤后肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的变化。结果：肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在大鼠坐骨神经损伤后显著性趋势随损伤时间而上调，其关键基因的表达量在坐骨神经损伤后不同时间点呈现显著性差异。结论：肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路参与周围神经的损伤和再生，提示神经损伤再生与神经退行性疾病密切相关。
[关键词] 周围神经损伤；转录组测序；生物信息学；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；信号通路
周围神经损伤是临床常见疾病，发病率呈逐年增高趋势。周围神经受损后，在神经元细胞、损伤侧近端和远端以及靶器官等多个位点引发一系列复杂的分子及细胞反应，包括损伤侧轴突破坏、损伤远端瓦勒变性、巨噬细胞和单核细胞迁移移除轴突和髓鞘碎片、施万细胞增殖迁移形成宾格内氏带等[1]。目前对周围神经损伤过程的组织形态学的认识已日趋深入和完善，但其内在分子机制仍有许多未知之处。肌萎缩性脊髓侧索硬化症是由于运动神经元变性而导致的一种神经退行性病变。本研究使用大鼠坐骨神经损伤模型，结合前期转录组测序结果[2]，检测坐骨神经损伤后肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的变化，以探讨神经退行性疾病和周围神经损伤再生的可能联系。
1 材料和方法
1.1 动物模型 成年雄性SD大鼠（南通大学实验动物中心提供）30只，随机分为5组，每组各6只。使用复合麻醉药进行腹腔麻醉，单侧臀部做斜形切口，暴露坐骨神经，按照先前实验方法[2]制作坐骨神经夹伤模型，使用医用镊子钳夹10秒后松开3秒，重复3次后予以缝合，伤后0、1、4、7、14天取损伤处坐骨神经，损伤后0天的样品作为对照组。
1.2 转录组测序 使用Trizol（Life technologies，Carlsbed，CA）提取大鼠损伤后0、1、4、7、14天坐骨神经RNA，使用RNeasy吸附柱（Qiagen，Valencia，CA）去除可能含有的DNA，得到高质量RNA样品。对RNA样品进行深度测序，使用带有多聚胸腺嘧啶的磁珠分离出mRNA，进行mRNA短片段化，并以mRNA短片段为模板合成cDNA。纯化的短双链cDNA碎片溶解于EB缓冲液，与lllumina测序适配器连接，选择合适的片段，通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化和后续的PCR扩增。得到的测序数据经质量控制筛选进行后续生物信息学分析[2]。
1.3 生物信息学分析 使用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）信息分析软件（Ingenuity System Inc，Redwood City，CA）分析，相较对照组损伤后1、4、7、14天差异表达的基因，并将这些差异表达的基因富集到经典信号通路中。使用热图生成并直观表达经典信号通路中基因表达变化趋势。
1.4 RT-PCR 使用 Prime-Script Reagent Kit（TaKaRa，Dalian，China）将RNA样品转化为cDNA，以其为模板，使用 SYBR Green Premix Ex Taq（TaKaRa）和特定引物，在Biosystems Stepone realtime PCR System进行基因扩增。检测基因的引物序列分别为：BAX（forward）5’-TGGCGATGAACTGGACAACA-3’，（reverse）5’-TAGAAAAGGGCAACCACCCG-3’；BID（forward）5’-GAACCCCGATACGGCAAGAA-3’，（reverse）5’-CTGGAAATAGGGAGACGCGG-3’；CASP3（forward）5’-GGAGCTTGGAACGCGAAGAA-3’，（reverse）5’-ACACAAGCCCATTTCAGGGT-3’；GAPDH（forward）5’-CCTTCATTGACCTCAACTACATG-3’；（reverse）5’-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。使用GAPDH作为内参，采用2△△Ct方法计算目标基因的相对表达量。
1.5 统计学处理 使用GraphPad Prism 6.0软件（GraphPad Softwar，Inc.，La Jolla，CA）对数据进行分析和作图，采用ANOVA检验对目标基因在损伤后不同时间点的表达量与对照组进行差异性比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在周围神经损伤后的显著性趋势变化 IPA信息分析软件统计了坐骨神经损伤后呈现显著性变化的经典信号通路，并将其按照显著性（P值）进行排列。在坐骨神经损伤后1天，肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的P值约为0.079［-log（P-value）=1.1］，位列所有经典信号通路的第317位。在损伤后4天、7天，尤其是损伤后14天，肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的P值显著下降，同时该信号通路在经典信号通路中的排名也显著上升。在损伤后14天，肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的P值约为0.0005［-log（P-value）=3.3］，位列所有经典信号通路的第105位（表1）。IPA结果提示肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在周围神经损伤后，尤其是神经损伤后较长时间点，被显著激活。
表1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在周围神经损伤后的显著性趋势变化
时间 -log（P-value） Rate损伤后1d 1.1 317损伤后4d 1.38 246损伤后7d 1.49 229损伤后14d 3.3 105
2.2 肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路分析 鉴于肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在神经损伤后被激活，我们根据IPA信息分析软件的经典信号通路信息，对该信号通路进行了进一步的研究分析。如肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路的通路图（图1）所示，肌萎缩性脊髓侧索硬化症可由于神经兴奋性中毒和氧化性损伤导致。在运动神经元内，钙离子经由L型电压控制的离子通道（L-type VOC）进入神经元细胞，调控多种生物学活性。细胞内钙离子浓度的升高会导致细胞兴奋性中毒，导致神经元的变性。细胞内含量过高的钙离子同时激活一氧化氮合成酶（NOS1）产生一氧化氮，后者在超氧化物歧化酶（SOD）作用下形成硝基酪氨酸，从而进一步导致神经元的损伤。肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者中常见神经丝L（NF-L）含量降低，缺失的NF-L导致NFM和NF-H的过度累积，造成神经丝的异常包涵，进而导致细胞兴奋性中毒和神经元损伤。同时，肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者常见编码SOD蛋白的基因突变、凋亡相关基因BAX表达量上调和BCL-2/XL下调，造成细胞色素C（CYCS）过度激活，损害线粒体的功能，导致机体的过氧化和神经元的凋亡。
图1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路
2.3 周围神经损伤后肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路中表达量变化的基因 转录组测序和信息学分析结果提示肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在神经损伤后的重要性，因此，我们将该通路涉及的基因在损伤后的不同时间点的表达量与其在对照组（0天）的表达量进行比较，并使用热图表示了所有差异表达的基因（图2，见封三）。图2显示在肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路中差异表达的36个基因中，约有1/3的基因在损伤后呈现下调趋势，而约有2/3的基因在损伤后呈现显著上调的趋势。
为了进一步验证测序结果的可靠性，BAX、BID和CASP3三个凋亡相关基因被选取进行RT-PCR验证。RT-PCR结果呈现与测序结果和热图结果的一致性，即凋亡相关基因BAX、BID和CASP3在坐骨神经损伤后表达量上调（图3）。
3 讨 论
周围神经损伤后，施万细胞去分化并大量增殖，促进轴突的再生和成髓鞘，从而促进损伤神经的再生和功能恢复。许多周围神经病变和神经元退行性疾病与错误的成髓鞘密切相关，轴突成髓鞘异常引起的功能受损是许多人类神经病变的潜在病因[1，3]。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症是一种致命的神经肌肉疾病，通过影响上下运动神经元而导致肌肉麻痹。大多数（90%）肌萎缩性脊髓侧索硬化症病例是零星不定时发生的，仅有小部分（10%）病例是家族遗传性导致的[4-5]。零星发生的肌萎缩性脊髓侧索硬化症的病因和病变机制迄今尚有很多不明之处[6-7]。有文献指出，肌萎缩性侧索硬化症患者有感觉障碍和神经传导速度减慢等感觉神经系统症状。对15例肌萎缩性侧索硬化症患者神经活检，发现8例患者有髓神经纤维脱髓鞘情况，3例患者情况严重[8]，提示肌萎缩性侧索硬化症可能与周围神经损伤有关。
图3 RT-PCR验证BAX、BID、CASP3的基因表达变化**P＜0.01；***P＜0.001
本实验结果表明，肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路在大鼠坐骨神经损伤后显著性趋势随损伤时间而上调，该信号通路中很多基因在损伤后不同时间点呈现显著性差异表达。PT-PCR验证结果也表明周围神经损伤后，肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号通路中BAX、BID和CACP3基因表达量总体呈上升趋势。BAX、BID和CACP3分别编码Bcl-2相关X蛋白质（Bcl-2-associated X protein）、BH3相互作用域死亡激动剂 （BH3-interacting domain death agonist）以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3），这些蛋白均通过调控细胞凋亡影响一系列生物学过程。研究表明，BAX和CASP-3表达量在有先兆肌萎缩性脊髓侧索硬化症的老鼠中显著上调，表明这些凋亡相关基因与肌萎缩性侧索硬化症的发作密切相关[9-11]。本研究中检测到的凋亡相关基因与此一致的表达趋势提示了周围神经损伤修复与肌萎缩性脊髓侧索硬化症的相关性，也提示了髓鞘的形成在神经系统疾病和发育过程中的重要作用，为神经损伤和神经退行性病变的进一步研究提供了一定的基础。
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High throughput sequencing identifies the involvement of Amyotrophic Lateral Sclerosis signaling in peripheral nerve injury
WANG Sijia,WU Chen,ZHANG Ming,HUANG Ling,CAI Hongyu,LI Guicai,YI Sheng
(Jiangsu Key laboratory of neuroregeneration,Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University,Jiangsu 226001)
[Abstract] Objective:To investigate the changes of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)signaling pathway in injured peripheral nerves.Methods:30 SD rats were randomly divided into four experimental groups and the control group. The sciatic nerves of SD rats were crushed and then collected at 0,1,4,7,and 14 days post injury.Deep sequencing and bioinformatic analysis were combined to analyze ALS signaling pathway.Results:ALS signaling pathway was involved in peripheral nerve injury and the significance of the ALS signaling pathway was elevated with the passage of time.Many critical genes in the ALS signaling pathway were also differentially expressed at different time points after peripheral nerve injury.Conclusion:ALS signaling pathway might be involved in peripheral nerve injury and regeneration,suggesting that peripheral nerve regeneration might be related with neurodegenerative diseases.
[Key words] peripheral nerve injury;transcriptome sequencing;bioinformatics;Amyotrophic Lateral Sclerosis;signaling
[中图分类号] Q189
[文献标志码]A
[收稿日期] -11-18
［文章编号］1006-2440（）01-0005-04
*[基金项目] 江苏省自然科学基金（BK0409）；江苏高校自然科学研究资助项目（15KJB180013）；南通大学引进人才科研启动费（14R29）。
**[作者简介]王思嘉，女，汉族，安徽亳州人，生于1995年9月，南通大学医学院级临床医学专业在读。 通信作者：易晟，E-mail: syi@
